重组人血清白蛋白在组成型毕赤酵母中重组表达及中试工艺研究

【摘要】人血清白蛋白（HumanSerumAlbumin，HSA）主要生理功能为运输功能和维持内环境相对稳定，具有抗凝血、清除自由基、维持血液正常的渗透压等功能。目前临床治疗中应用的HSA均来自人血浆提取，由于人血浆来源有限，产量远远不能满足市场需求。随着基因工程技术的发展，已有日本MitsubishiTanabePharma公司、英国DELTA公司和华北制药致力于研究并推动酵母重组表达药用HSA的产业化进程。现有技术多采用毕赤酵母表达系统，通过甲醇控制醇氧化酶启动子（pAOX1）诱导表达重组人血清白蛋白（RecombinantHumanSerumAlbumin，rHSA）。考虑到rHSA的临床治疗用量，生产中发酵规模至少为30000L，甲醇用量十分巨大，储藏和应用均非常困难，严重影响发酵生产的安全性。基于以上问题，本论文研究利用三磷酸甘油脱氢酶启动子（pGAP）的毕赤酵母表达系统重组表达rHSA，在发酵过程中仅使用甘油一种碳源，生产工艺简单且缩短了发酵周期，具体研究内容简述如下：本论文根据HSA的氨基酸序列及毕赤酵母对密码子的偏好性，将HSA基因进行了密码子优化，重组到pGAPZaA表达载体，用电转化法将目的基因导入X-33酵母基因组中，经Zeocin抗性培养基和PCR鉴定筛选出成功整合到酵母基因组的工程菌，菌株在摇瓶中培养，经SDS-PAGE和wseternblot鉴定了rHSA的表达。菌株在发酵罐上进行培养，研究X-33组成型表达rHSA菌株发酵的最适发酵条件。将培养基的pH值分别调节至4.0、5.0和6.0，培养72h，测定表达量可知，pH=6.0的发酵罐rHSA表达量最高，因此，pH=6.0是X-33组成型表达rHSA菌株的最佳发酵pH值。研究了补充氮源的最佳方式，分别向四个发酵罐中补加无菌水、（NH4）2SO4、（NH4）H2PO4和H3PO4，培养72h，测定蛋白表达量可知，补加（NH4）H2PO4的菌株表达量最高，因此（NH4）H2PO4是X-33组成型表达rHSA菌株氮源最佳的选择。通过对rHSA发酵的中试工艺进行了初步的探索，为组成型X-33毕赤酵母菌表达的rHSA应用于工业生产打下基础。
【作者】杨楠；
【导师】孙非；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】重组人血清白蛋白；毕赤酵母；发酵；组成型表达；重组表达；GAP启动子；

【参考文献】
[1]魏武.循环水圆形养殖池数值模拟及结构优化[D].广东海洋大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[2]邹京.先进微处理器高密度封装协同设计与仿真技术研究[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[3]陈金丹.近阈值标准单元包研究[D].宁波大学,电路与系统,2013,硕士.
[4]王利众.俄汉科学语言句法对比研究[D].黑龙江大学,2002.
[5]王少燕.多媒体通信中的音视频同步问题研究与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2003,硕士.
[6]袁学武.我国洪涝灾害事件卫生应急管理研究[D].南方医科大学,社会医学与卫生事业管理,2012,硕士.
[7]吕玉兰.制造业企业物流模式及其选择研究[D].东南大学,2005.
[8]贺肖鹏.宗白华中国画理论研究[D].河北大学,艺术学,2014,硕士.
[9]任翔.安徽省农村金融效率实证研究[D].安徽大学,金融学,2013,硕士.
[10]王明明.语域视角下的《围城》语码转换研究[D].山东师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[11]黄亮.在思想史与哲学史之间[D].复旦大学,中国哲学,2012,博士.
[12]赵唐民.悬赏广告制度研究[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[13]王光锁.乳糖化修饰纳米基因载体的制备及肝靶向性研究[D].中南大学,外科学,2003,硕士.
[14]王晴.单相高功率因数可逆整流器的研究[D].福州大学,电机与电器,2004,硕士.
[15]柴燚.中空海藻酸钙微胶囊的性质及其固定化枯草杆菌生产纳豆激酶的研究[D].浙江大学,2004.
[16]孙钢.基于.NET平台的服务质量管理研究[D].广西大学,2004.
[17]李梁.杏皮渣膳食纤维理化性质分析及应用研究[D].新疆农业大学,食品科学,2012,硕士.
[18]白跃伟.结构造型技术及其在机械三维CAD中的应用[D].华中科技大学,2004.
[19]于瞳.我国低碳审计若干问题研究[D].吉林财经大学,会计学,2014,硕士.
[20]方涛.氧化镍/石墨烯复合材料的制备及电容性能研究[D].上海大学,2013.
[21]周琪.广林九号桉叶精油的提取及其生物活性研究[D].广西科技大学,生物化工,2013,硕士.
[22]康琼.无线传感器网络中分簇算法的研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[23]刘智.基于ZigBee的智能化草坪自动喷水系统[D].江苏科技大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[24]黄雄华.网络安全解决手段及入侵检测系统[D].西南交通大学,2003.
[25]潘兵.ROA持续性及其动量组合[D].复旦大学,财务管理,2012,硕士.
[26]李丽.一类广义集值变分不等式与互补问题的算法及收敛性[D].山东师范大学,应用数学,2013,硕士.
[27]王小梅.燃煤电厂清洁生产评价方法比较研究[D].辽宁工程技术大学,环境工程,2011,硕士.
[28]彭苏.基于通用设计理念的厨房环境设计研究[D].中南林业科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[29]叶欢,桂蒙,邵红玉,潘红英.护理人员人际冲突处理模式的研究现状[J].护理与康复,2014,08:740-743.
[30]尹沛人.社会工作视角下的国有企业员工职业倦怠研究[D].南京理工大学,社会学,2013,硕士.
[31]路漫漫.融合PSO的N-FINDR改进端元提取算法研究[D].大连海事大学,计算机技术,2014,硕士.
[32]王洁琼.有机二硫化物正极材料结构与性质的理论研究[D].厦门大学,物理化学,2014,硕士.
[33]杨昊.一种16位1GSPS MCML D/A转换器设计[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[34]姚振华.所有权保留性质问题研究[D].扬州大学,民商法学,2012,硕士.
[35]陈梅.中外合资企业外商技术出资的立法反思与完善[D].华中师范大学,经济法,2013,硕士.
[36]段沣凌.科技教育在农村籍强制隔离戒毒人员矫治中的作用研究[D].湖南农业大学,农业科技组织与服务,2012,硕士.
[37]何亚平,费世民,蒋俊明,陈秀明,张旭东,何飞.不同龄级划分方法对种群存活分析的影响——以水灾迹地油松和华山松种群生存分析为例[J].植物生态学报,2008,02:448-455.
[38]王雷.中国家用制冷工业替代与节能进程[J].精细与专用化学品.1999(22)
[39]崔成日.盐酸戊乙奎醚对宫腔镜手术静脉麻醉病人心率变异性的影响[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[40]李尚.基于软件无线电平台雷达方式通信研究与实现[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[41]陈军.基于ARM-Linux的嵌入式产品平台构建[D].浙江大学,2004.
[42]王政国,王世早,杨振顺.ICP—AES法测定低合金钢中合金元素[J].一重技术.2001(Z1)
[43]郑雅雯.肝脏的不规则模拟切除—设计与实现[D].华中科技大学,生物医学工程,2013,硕士.
[44]赵小飞.合肥荣事达三洋公司物流绩效评价研究[D].合肥工业大学,物流工程,2013,硕士.
[45]史俊超.明代延绥镇长城研究[D].西北大学,历史地理学,2014,硕士.
[46]王帅.非小细胞肺癌分子标志物的临床意义及靶向治疗相关研究[D].北京协和医学院,肿瘤学,2014,博士.
[47]孙铁军,李喜瑞,杨松,范学文,何福文.DIVA技术在Tenere地区的应用[J].石油地球物理勘探,2010,05:700-704+792+619.
[48]董明明,王晓利,韩立峰,李岳松,张彦欣.高职院校金融专业大学毕业生就业现状[J].商,2014,08:275.
[49]王成然.典型电气设备对电压暂降的敏感度问题研究[D].华北电力大学（北京）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[50]张茜.青岛市热力景观变化研究[D].中国石油大学（华东）,地图制图学与地理信息工程,2012,硕士.